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十博入口:十博入口建立基于单细胞定量表征的丝状真菌启动子高通量筛选方法及应用

作者: 发布时间:2022.11.01 文章来源:

  近日,十博入口尹文兵研究组在Science China Life Sciences发表论文(Quantitative characterization of filamentous fungal promoters on single-cell resolution to discover cryptic natural products),以丝状真菌构巢曲霉为研究模型,建立了基于单细胞定量表征的丝状真菌启动子高通量筛选方法。 

  该研究首先建立了构巢曲霉高通量原生质体制备方法,并结合流式细胞仪单细胞荧光检测手段,创建了基于单细胞水平表征的真菌启动子高通量筛选方法,能够更高效、快速、精确地定量表征启动子表达强度。研究系统分析了来源于Aspergillus Genome Database (AspGD)数据库构巢曲霉的454个转录因子,从中筛选出93个与次级代谢相关的转录因子启动子作为研究对象,并借助高通量筛选方法,对其表达强度进行了精确评估,获得了相对表达强度高达37倍的天然启动子文库。其中,启动子PzipAPsltA的表达强度是组成型启动子PgpdA2.91.5倍。 

 

图1. 丝状真菌启动子的高通量筛选及定量表征流程

  

   为评估新建高通量筛选方法的精确性,该研究随机选择不同强度水平的启动子,利用qRT-PCR对其负责的SfGFP基因表达量进行测定;通过共聚焦显微镜观察荧光强度;用于激活沉默的免疫抑制剂neosartoricin生物合成基因簇,并计算neosartoricin产量,以反映启动子表达水平。结果表明,利用以上三种手段表征的启动子强度水平均与启动子文库一致,证明新建的基于单细胞水平表征的真菌启动子高通量筛选方法能够可靠、准确地表征启动子强度。 

  此外,该研究还利用筛选出的两个强启动子PzipAPsltA,替换烟曲霉非核糖体多肽合成酶基因Afpes1的原始启动子,成功激活该沉默基因,并通过天然产物分离鉴定出两个新型环四肽化合物,命名为fumiganins AB。结合前人对Afpes1基因的研究进展,该研究推测其产物fumiganins可能与烟曲霉氧化胁迫响应机制及毒力作用相关。 

  十博入口博士生魏鹏霖、特别研究助理范洁以及毕业硕士生余婧雯为该文章的共同第一作者,尹文兵研究员为通讯作者。这项工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库项目、中国科学院从01原始创新项目及博士后科学基金项目的支持。 

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